PCR聚合酶鏈反應(yīng)

原理篇
第1章 PCR技術(shù)基本原理3
1.1 基本原理3
1.2 PCR反應(yīng)動力學(xué)5
1.3 PCR技術(shù)的特點6
1.4 PCR反應(yīng)體系的組成6
1.5 PCR所需設(shè)備和器材9
參考文獻(xiàn)9
第2章 PCR技術(shù)的發(fā)展11
2.1PCR新技術(shù)的發(fā)展11
2.2其他核酸擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展15
參考文獻(xiàn)18
第3章 PCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用19
3.1 PCR在醫(yī)學(xué)檢驗中的應(yīng)用19
3.2 對PCR技術(shù)醫(yī)學(xué)應(yīng)用的正確認(rèn)識21
3.3 PCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的管理22
參考文獻(xiàn)23
操作方法/技術(shù)篇
第4章 常規(guī)PCR27
4.1 常規(guī)PCR反應(yīng)體系說明27
4.2 PCR操作27
4.3 PCR條件優(yōu)化48
參考文獻(xiàn)55
第5章 反轉(zhuǎn)錄PCR57
5.1 RTPCR原理57
5.2 RNA的提取和純化60
5.3 RTPCR的操作66
5.4 衍生技術(shù)——基因表達(dá)系列分析82
參考文獻(xiàn)85
第6章 實時熒光定量PCR87
6.1 原理87
6.2 實驗操作與優(yōu)化89
6.3 實時定量PCR數(shù)據(jù)分析93
6.4 qPCR的常用軟件——PrimerExpress99
6.5 qPCR儀的選擇107
參考文獻(xiàn)112
第7章 免疫PCR115
7.1 原理115
7.2 實驗操作121
7.3 條件優(yōu)化125
參考文獻(xiàn)128
第8章 利用PCR構(gòu)建突變體131
8.1 定點突變131
8.2 隨機(jī)誘變PCR144
8.3 衍生技術(shù)147
參考文獻(xiàn)155
第9章 未知序列的克隆157
9.1 RNA連接酶介導(dǎo)的cDNA5′末端快速擴(kuò)增157
9.2 單側(cè)特異性引物擴(kuò)增未知DNA序列161
9.3 反向PCR163
參考文獻(xiàn)166
第10章 其他醫(yī)學(xué)領(lǐng)域常見PCR技術(shù)167
10.1 PCR技術(shù)應(yīng)用于病原微生物檢測鑒定167
10.2 遺傳性疾病診斷的常用PCR技術(shù)175
10.3 PCR技術(shù)在腫瘤方面的應(yīng)用182
10.4 甲基化特異性PCR186
參考文獻(xiàn)193
第11章 PCR軟件使用195
11.1 Oligo6的使用197
11.2 PerlPrimer的使用206
11.3 引物在線設(shè)計210
常見問題解答
1 為什么完全沒有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物？215
2 為什么除目的條帶外，還出現(xiàn)多條非特異擴(kuò)增條帶？215
3 為什么目的條帶未出現(xiàn)但有非特異擴(kuò)增條帶出現(xiàn)？216
4 為什么PCR產(chǎn)物很少？216
5 為什么同一批PCR反應(yīng)中包括陰性對照在內(nèi)的平行管出現(xiàn)相同的陽性結(jié)果？216
6 為什么PCR產(chǎn)物出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶？216
7 如何提高PCR的保真度？217
8 如何減少PCR污染？217
9 如何特異擴(kuò)增極微量的目的基因片段？217
10 如何確定最適退火溫度？217
11 如何進(jìn)行長片段PCR擴(kuò)增？218
12 如何提高PCR的特異性？219
13 RNA制備過程中如何避免RNase污染？219
14 進(jìn)行RNA相關(guān)實驗時，塑料制品.玻璃和金屬物品需要怎么處理？219
15 什么時候需要分離mRNA?220
16 如何判定分離的總RNA的純度？220
17 提取RNA時什么時候需要加入RNA載體?220
18 如何除去純化的RNA中微量的基因組DNA?220
19 純化的RNA樣品如何保存？220
20 組織和細(xì)胞樣品如何收集和保存？220
21 如何估計RNA的產(chǎn)量？220
22 RNA制備過程中哪個環(huán)節(jié)要特別注意？221
23 RTPCR要求模板RNA的260nm/280nm的值最低為多少，如果太低是不是會影響結(jié)果？221
24 RTPCR時的引物設(shè)計是不是一定要先知道目的基因的序列？221
25 如何選擇RTPCR的方法？221
26 RTPCR的常用內(nèi)標(biāo)猹瞐ctin和GAPDH的使用是否有選擇性，比如不同的細(xì)胞.不同的刺激？221
27 如何確定PCR的線性期？222
28 引物的特異退火溫度怎樣設(shè)定？是否可以根據(jù)GC和AT含量算出？
是否可以用引物報告單上的Tm值？222
29 PCR時20霯體系中cDNA應(yīng)加多少比較合適？MgCl2應(yīng)加多少？
各個成分的量有無確定標(biāo)準(zhǔn)？20霯是指體積還是量?222
30 PCR結(jié)果進(jìn)行電泳，actin有，但無其他目的條帶，有幾種原因？是否與cDNA的量少有關(guān)？Mg2+太多是否會抑制Taq酶的活性？223
31 RTPCR的引物如何設(shè)計？223
32 如何確認(rèn)RNA的質(zhì)量？224
33 RTPCR中的定量如何控制？225
34 RTPCR的實驗設(shè)計需注意哪些事項？225
35 RTPCR結(jié)果可以代替蛋白表達(dá)的結(jié)果嗎？226
36 DNA殘留是否會影響RTPCR？226
37 RTPCR定量測定中產(chǎn)物長度是否有限制？226
38 RTPCR中內(nèi)參照的意義是什么？226
39 RTPCR中應(yīng)選擇什么作為內(nèi)參照？226
40 RTPCR定量實驗中的凝膠成像要注意什么？226
41 提取RNA時沉淀RNA步驟要注意什么？227
42 RNA的保存要注意什么？227
43 從臨床樣品中提取RNA有哪些注意事項？227
44 PCR基因誘變的意義是什么？227
45 定點突變時，轉(zhuǎn)化率低或僅能得到很少菌落怎么辦？227
46 怎么解決定點突變中低突變率的問題？228
47 如何避免PCR定點誘變中出現(xiàn)的假陽性問題？228
48 怎樣控制PCR隨機(jī)基因突變的突變率？228
49 在隨機(jī)突變PCR后，看不到目的DNA產(chǎn)物條帶怎么辦？228
50 QFPCR實驗中無CT值（信號）出現(xiàn)是什么原因?229
51 QFPCR中CT值出現(xiàn)過晚是什么原因？229
52 QFPCR中標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系不佳是什么原因?229
53 QFPCR中陰性對照也出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增是什么原因?230
54 QFPCR中熔解曲線不止一個主峰是什么原因?230
55 QFPCR中擴(kuò)增效率低是什么原因?230
56 QFPCR中實驗重復(fù)性不好是什么原因?230
57 如何知道QFPCR中變性溫度是否合適?230
58 QFPCR中如何選擇變性時間?230
59 QFPCR中如何知道退火溫度和時間是否合適?231
60 QFPCR中應(yīng)該在哪一步讀取熒光信號?231
61 與常規(guī)的5′RACE相比，RMLRACE有什么特點?231
62 IPCR的主要用途是什么?231
63 PCRSSCP實驗中有哪些注意事項？232
64 如何優(yōu)化多重PCR反應(yīng)？233
65 原位PCR要注意哪些問題？234
66 PCR測序?qū)嶒炓⒁饽男┦马棧?36
67 MSP與常規(guī)PCR有何不同？236
68 為何有些組織DNA樣品在MSP中同時出現(xiàn)甲基化和非甲基化兩種結(jié)果？236
69 MSP中如何設(shè)置對照？236
70 采用軟件設(shè)計的引物是否一定比自己根據(jù)經(jīng)驗設(shè)計的引物好？237
附錄
附錄1 臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室管理暫行辦法241
附錄2 臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室基本設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)245
附錄3 臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室工作規(guī)范247