胡格諾派教徒要求凱瑟琳·德·美第奇，作為太后，制止吉斯兄弟以她年輕兒子的名義，對(duì)他們展開的迫害。凱瑟琳開始運(yùn)用她的權(quán)力了，但是，1560年，弗蘭西斯二世去世，由他十歲的弟弟繼位，成為查理九世。如果凱瑟琳的大兒子已經(jīng)表現(xiàn)得很令人失望，那么她的二兒子甚至更糟；來(lái)自他父親的遺傳基因，和凱瑟琳的父親、患梅毒的洛倫佐、烏爾比諾公爵的遺傳基因的結(jié)合，已經(jīng)顯示出不吉利的征兆。像他的哥哥一樣，查理九世身體相當(dāng)虛弱，除此之外，他還遭受精神不定的痛苦。

這次，凱瑟琳決定采取措施，并確信她會(huì)被任命為攝政王；她的目的是不惜任何代價(jià)維護(hù)和平。新教現(xiàn)在已經(jīng)有一些合法權(quán)利，但是，實(shí)際上，正在國(guó)家迅速蔓延的越來(lái)越不利的氛圍中，這些權(quán)利大部分被忽視。凱瑟琳能制定法律，但無(wú)權(quán)實(shí)施法律，1562年，國(guó)內(nèi)爆發(fā)內(nèi)戰(zhàn)。一年后，吉斯公爵弗蘭西斯，在奧爾良圍攻新教徒時(shí)被一名間諜擊中；當(dāng)審訊間諜時(shí)，他承認(rèn)他是受雇于新教領(lǐng)袖阿德米拉爾·德·科利尼。

1563年，內(nèi)戰(zhàn)結(jié)束時(shí)，查理九世在魯昂最高法院宣布到了法定統(tǒng)治年齡，接下來(lái)，凱瑟琳陪同年輕的國(guó)王對(duì)法國(guó)進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)兩年的巡視，因此，她能夠把自己展示給人民，并獲得他們的忠心。但是，吉斯黨派和他們激進(jìn)的天主教支持者們，專注于在1567年和1568年再次發(fā)動(dòng)的內(nèi)戰(zhàn)。凱瑟琳盡全力促使和解；她與吉斯黨派進(jìn)行談判，甚至邀請(qǐng)新教領(lǐng)袖阿德米拉爾·德·科利尼會(huì)見國(guó)王。當(dāng)科利尼抵達(dá)巴黎，凱瑟琳恰巧不在，去照看她生病的女兒克勞德洛林公爵夫人?？评嵩谌狈?jīng)驗(yàn)的且易受感動(dòng)的年輕查理九世身上，運(yùn)用他的全部魅力，他們?cè)诒R浮宮的王室里進(jìn)行徹夜長(zhǎng)談。顯然，科利尼試圖破壞凱瑟琳對(duì)國(guó)王的支配，當(dāng)這話被凱瑟琳獲悉，她氣憤地返回巴黎，很快重申她的權(quán)力高于意志薄弱的查理九世。

最后，試圖使兩派之間達(dá)成和解，凱瑟琳安排她的女兒瑪格麗特與年輕的波旁王室血統(tǒng)的新教領(lǐng)袖、納瓦拉的亨利結(jié)婚；1572年8月，天主教和新教的領(lǐng)袖聚集巴黎，見證這個(gè)婚禮。不顧民眾的慶祝表示，巴黎圣母院和教堂塔樓發(fā)出的鐘聲，在城市上空回蕩，街上的氣氛變得不安起來(lái)，巴黎正處在夏季酷暑階段，熱得人喘不過氣來(lái)。教皇明顯表明他反對(duì)這個(gè)婚姻，聲稱，天主教和新教之間不會(huì)聯(lián)合；典禮不能在巴黎圣母院舉行，立刻轉(zhuǎn)到外面的廣場(chǎng)舉行。正當(dāng)這時(shí)候，新教領(lǐng)袖炫耀地“上前一步”站在典禮臺(tái)前面，給新婚夫婦主持了彌撒。

四天后，8月20日，星期三，慶祝達(dá)到高潮時(shí)，有人想暗殺科利尼。在他正走在德－貝蒂西街（現(xiàn)在的德－里沃利街）上時(shí)，一顆火繩槍的子彈從樓上的一扇窗子射下來(lái)，不過剛好，科利尼正彎下腰系鞋帶，所以只是受了傷。后來(lái)發(fā)現(xiàn)開槍的那間房子是屬于吉斯家族的一個(gè)家臣的。很明顯，他們是為弗蘭西斯·吉斯公爵的暗算尋求報(bào)復(fù)。

凱瑟琳和查理九世趕緊來(lái)到科利尼床旁，科利尼要求與國(guó)王單獨(dú)談?wù)?。在返回盧浮宮的路上，凱瑟琳聲色俱厲地威逼查理九世，迫使他透露在他們密談時(shí)科利尼都說了些什么——很明顯，科利尼告誡年輕的國(guó)王不要依賴凱瑟琳。此時(shí)，巴黎正處在混亂當(dāng)中：兩百名胡格諾教徒占領(lǐng)了坐落在德－貝蒂西街的住宅，一群武裝的胡格諾教徒在街上搜尋。市場(chǎng)關(guān)閉、商店關(guān)門、市民躲在家里。

此時(shí)，需要迅速采取行動(dòng)，否則，首都的形勢(shì)將失去控制，極有可能在國(guó)內(nèi)爆發(fā)另外一場(chǎng)內(nèi)戰(zhàn)。第二天，查理九世證實(shí)科利尼事實(shí)上正在圖謀害他，由于背叛了新朋友，據(jù)說他已經(jīng)變得精神錯(cuò)亂。這是查理九世的獨(dú)自行為，還是他母親的慫恿，不得而知，但是，8月24日，星期日一大早，圣巴多羅馬日，一個(gè)吉斯派成員率領(lǐng)一群瑞士王室守衛(wèi)隊(duì)，突然攔住科利尼，并把他刺死，把他的尸體從窗戶扔到街道下面。這是王室軍隊(duì)受巴黎天主教指使屠殺胡格諾教徒的信號(hào)。胡格諾教徒——男人、女人和孩子——被從他們的床上拖到城市各處，并被殺害，大屠殺持續(xù)了兩天，兩天中，兩千五百人被殺。當(dāng)圣巴多羅馬日大屠殺的消息傳遍法國(guó)，同樣的屠殺也發(fā)生在奧爾良、魯昂、里昂、波爾多和圖盧茲；總共，多達(dá)八千人喪命。這標(biāo)志著一系列宗教戰(zhàn)爭(zhēng)的開始，接下來(lái)的三十年，法國(guó)遭受著宗教戰(zhàn)爭(zhēng)之苦。

很有可能，凱瑟琳·德·美第奇，至少要為圣巴多羅馬日大屠殺負(fù)部分責(zé)任。是由于恐慌，還是把這視為唯一的途徑，不得而知；盡管讓人可能有點(diǎn)兒懷疑，如果她不首先打擊，那么她和國(guó)王的生命，將受到極大的威脅。無(wú)論哪一方面，凱瑟琳·德·美第奇都將因這次血債——法國(guó)歷史上最無(wú)恥的行為而受譴責(zé)。從此以后，她將被視為法國(guó)天主教對(duì)抗胡格諾新教的領(lǐng)袖。