1926年元旦，國(guó)民黨“二大”在廣州召開(kāi)，毛澤東作為湖南代表出席，并再次當(dāng)選為國(guó)民黨中央候補(bǔ)執(zhí)行委員。在會(huì)上，毛澤東和其他共產(chǎn)黨人一起，團(tuán)結(jié)國(guó)民黨左派，積極進(jìn)行反對(duì)“西山會(huì)議派”的斗爭(zhēng)。1月8日，毛澤東代表國(guó)民黨中央宣傳部作《宣傳報(bào)告》。他在結(jié)束語(yǔ)部分講道：“兩年來(lái)在革命宣傳與反革命宣傳相對(duì)抗之中，革命宣傳確是取一種攻勢(shì)……反革命宣傳卻始終是一種守勢(shì)。為了招架不住，才抬出‘反共產(chǎn)’、‘赤色帝國(guó)主義’這兩塊擋箭牌來(lái)。這種對(duì)抗攻守的現(xiàn)象，乃中國(guó)革命勢(shì)力日益團(tuán)結(jié)進(jìn)取，而反革命勢(shì)力日益動(dòng)搖崩潰的結(jié)果”。在毛澤東等中國(guó)共產(chǎn)黨人和國(guó)民黨左派的共同努力下，中國(guó)國(guó)民黨第二次全國(guó)代表大會(huì)通過(guò)了《處分違犯本黨紀(jì)律黨員決議案》、《彈劾西山會(huì)議決議案》等，決定永遠(yuǎn)開(kāi)除鄒魯、謝持的黨籍，對(duì)居正、石青陽(yáng)、葉楚傖等十二人提出警告，責(zé)其改正，命令葉楚傖將上?！睹駠?guó)日?qǐng)?bào)》交出改組，責(zé)令戴季陶限期反省。大會(huì)給“西山會(huì)議派”以沉重的打擊。

蔣介石是國(guó)共合作中后期統(tǒng)一戰(zhàn)線內(nèi)出現(xiàn)的新右派的代表。1926年3月，蔣介石制造了反共的“中山艦事件”。這是蔣介石向共產(chǎn)黨和國(guó)民黨左派發(fā)起進(jìn)攻的信號(hào)。事件發(fā)生后，毛澤東極力主張給予以蔣介石為代表的新右派以堅(jiān)決回?fù)?。茅?沈雁冰)回憶說(shuō)：“中山艦事變的第二天晚上，毛主席同我談起大局形勢(shì)，記得主席說(shuō)了大體是以下的一些話：蔣介石現(xiàn)在掌握的實(shí)力唯第一軍，而第一軍的下級(jí)軍官和士兵大部分是有覺(jué)悟的，就省城而言，蔣的實(shí)力是大的，但就全局而言，蔣的實(shí)力是小的。他此番制造中山艦事件，向我們突然進(jìn)攻，一是威脅，二是試探。我方示弱，他就要得寸進(jìn)尺；我方強(qiáng)硬，他就要知難而退。故我方萬(wàn)萬(wàn)不能示弱妥協(xié)，要堅(jiān)持同他斗爭(zhēng)。”毛澤東還極力主張“把我們當(dāng)時(shí)掌握的武裝力量集中在粵、桂邊境某地(我忘其名)，同時(shí)說(shuō)服國(guó)民黨左派撤出廣州，爭(zhēng)取第一軍外各軍(他們同蔣本來(lái)有矛盾)反蔣，至少使他們中立，名正言順地聲討蔣背叛統(tǒng)一戰(zhàn)線，破壞國(guó)共合作，以武力對(duì)武力，逼蔣下臺(tái)，削弱他的兵權(quán)?！泵珴蓶|還進(jìn)一步分析了當(dāng)時(shí)各派政治力量及第一軍以外各軍的情況，他指出：“假若我方退讓，則他們會(huì)由于蔣的利誘和威脅而倒向蔣?！泵珴蓶|積極將上述意見(jiàn)和主張向蘇聯(lián)軍事顧問(wèn)團(tuán)代理團(tuán)長(zhǎng)季山嘉和中共兩廣區(qū)委書(shū)記陳延年提出建議。但是，季山嘉堅(jiān)決反對(duì)。陳延年猶豫不決，說(shuō)“不敢作主”，要“請(qǐng)示上海中央”才能決定。最后，毛澤東的正確主張沒(méi)有被以陳獨(dú)秀為首的黨中央所接受，相反采取了退讓妥協(xié)的政策，從而使蔣介石首先順利地控制了國(guó)民革命軍第一軍和黃埔軍校的領(lǐng)導(dǎo)權(quán)。“中山艦事件”后，從黃埔軍校和第一軍退出的共產(chǎn)黨員達(dá)250多人，毛澤東和周恩來(lái)建議把這批共產(chǎn)黨員派到其他軍中去，建立葉挺獨(dú)立團(tuán)式的革命軍隊(duì)，但陳獨(dú)秀又拒絕了這一正確主張，因此這個(gè)計(jì)劃未能完全實(shí)行。

1926年5月，蔣介石又在國(guó)民黨二屆二中全會(huì)上，提出所謂《整理黨務(wù)案》，規(guī)定共產(chǎn)黨在國(guó)民黨中央及省、市黨部任執(zhí)行委員的人數(shù)不得超過(guò)全體委員會(huì)的三分之一，共產(chǎn)黨員不得擔(dān)任國(guó)民黨中央的部長(zhǎng)等等。這是蔣介石企圖限制和削弱中國(guó)共產(chǎn)黨在統(tǒng)一戰(zhàn)線中的領(lǐng)導(dǎo)地位，陰謀篡奪國(guó)民黨黨權(quán)的又一個(gè)嚴(yán)重反革命步驟。中共中央派張國(guó)燾、彭述之去指導(dǎo)出席這次會(huì)議的中共黨團(tuán)，在黨團(tuán)會(huì)議上討論《整理黨務(wù)案》時(shí)，大家意見(jiàn)很不一致。最后，張國(guó)燾按照他同陳獨(dú)秀商定的讓步方針，要大家簽字接受。毛澤東拒絕簽字，主張“堅(jiān)決頂住”，同時(shí)，在國(guó)民黨二屆二中全會(huì)表決《整理黨務(wù)案》時(shí)，他也沒(méi)有舉手。但是，由于陳獨(dú)秀等的退讓方針，《整理黨務(wù)案》還是被通過(guò)。擔(dān)任國(guó)民黨中央部長(zhǎng)的共產(chǎn)黨員被迫全部辭職。毛澤東也離開(kāi)了國(guó)民黨中央宣傳部。

隨著北伐戰(zhàn)爭(zhēng)的勝利進(jìn)行，蔣介石欲篡奪黨、政、軍大權(quán)，建立獨(dú)裁統(tǒng)治的面目更加暴露無(wú)遺。1927年1月，中共和國(guó)民黨右派在武漢地區(qū)開(kāi)展了以反對(duì)蔣介石軍事獨(dú)裁為中心內(nèi)容的“提高黨權(quán)運(yùn)動(dòng)”，而黨權(quán)運(yùn)動(dòng)的最高峰是3月中旬在武漢召開(kāi)的國(guó)民黨二屆三中全會(huì)。毛澤東出席了這次會(huì)議，主張堅(jiān)決反對(duì)以蔣介石為首的右派勢(shì)力。鑒于蔣介石和國(guó)民黨中央執(zhí)行委員會(huì)主席張靜江曾于1月3日在南昌召集中央政治會(huì)議臨時(shí)會(huì)議，擅自決議中央黨部和國(guó)民政府暫住南昌，挑起“遷都之爭(zhēng)”的事實(shí)，為防止當(dāng)時(shí)仍留在南昌的蔣介石、張靜江故伎重演，毛澤東在7日的預(yù)備會(huì)上提議：“在大會(huì)期間，政治會(huì)議停止開(kāi)會(huì)，如有重大事故發(fā)生，應(yīng)付與主席團(tuán)全權(quán)辦理”。這一提議得到于樹(shù)德的贊同。表決時(shí)，多數(shù)通過(guò)。毛澤東在會(huì)上還主張取消蔣介石操縱的黃埔同學(xué)會(huì)，亦獲全體通過(guò)。在共產(chǎn)黨人和國(guó)民黨左派的共同努力下，全會(huì)通過(guò)了多項(xiàng)限制蔣介石權(quán)力的決議。

蔣介石制造“贛州慘案”之后，3月15日，毛澤東主持的中央農(nóng)民運(yùn)動(dòng)講習(xí)所舉行陽(yáng)新、贛州死難烈士追悼會(huì)。毛澤東在會(huì)上發(fā)表演說(shuō)，指出：“在這革命的范圍內(nèi)，竟不斷演出慘殺農(nóng)工的事實(shí)，由此可證明封建的殘余勢(shì)力，正準(zhǔn)備著秣馬厲兵，向我們作最后的掙扎啊!從今日起，我們要下一決心，向那些反動(dòng)分子勢(shì)力進(jìn)攻，務(wù)期達(dá)到真正目的?！痹诠伯a(chǎn)黨人和國(guó)民黨左派的領(lǐng)導(dǎo)下，武漢地區(qū)掀起一個(gè)規(guī)模巨大的反蔣運(yùn)動(dòng)，這是武漢政府時(shí)期反對(duì)國(guó)民黨右派的高峰。