1925年1月，中共第四次代表大會在上海舉行。陳獨秀被選為中央局總書記兼組織部主任。10月，陳獨秀出席了在北京召開的中央委員會擴大會議。

1927年4月27日，中央第五次代表大會在武漢召開。陳獨秀被選為黨的總書記。在會上，陳獨秀的長子陳延年、次子陳喬年同時被選為中央委員。陳延年同時被選為政治局候補委員。

1927年大革命失敗后，陳延年、陳喬年相繼被國民黨殺害。陳延年和陳喬年于1922年6月至1923年先后赴法國勤工儉學和赴莫斯科東方大學學習。陳延年曾先后任中共廣東區(qū)委組織部長、區(qū)委書記，中共江浙區(qū)委書記，江蘇省委書記，1927年6月29日犧牲時，年僅29歲。陳喬年先后任中共北京地委組織部長、北方區(qū)委組織部長，中共湖北省委書記，中共中央組織部副部長，中共江蘇省委組織部長等職。1928年1月19日犧牲時，年僅26歲。大半年時間內(nèi)，陳獨秀痛失兩個愛子，身心受到巨大摧殘。

陳獨秀曾經(jīng)對濮清泉（濮德治）說：第五次代表大會，自己成為眾矢之的，大家罵我是“右傾”機會主義、投降主義，我投降了哪個？蔣介石把延年、喬年都殺了，我投降他嗎？汪精衛(wèi)高唱：“革命的到左邊來，不革命的滾開去?！辈粌H我以為他是“左派”，連斯大林也認為他是“左派”。

1929年11月5日，陳獨秀被開除黨籍。在這期間，陳獨秀逐漸接受了蘇聯(lián)托洛茨基的觀點，對共產(chǎn)國際的獨裁專制頗為不滿，辦刊物、寫文章聲明中國的問題應該由中國人自己研究解決。

陳獨秀雖被開除黨籍，但他并未放棄信仰和追求，并且堅決反對南京國民黨政府的黑暗統(tǒng)治。

1932年10月，在上海家中，國民黨以“危害民國罪”為名將陳獨秀逮捕入獄。

陳獨秀是被費克勤出賣被捕的。上海市長吳鐵城獲悉后立即電告南京政府，蔣介石電示稱陳獨秀系危害民國罪，應交法院審判，將其押解南京軍事法庭審判。

1933年4月14日，江蘇省高等法院開始公開審理陳獨秀的案件，指控他“危害民國”。陳獨秀大聲抗辯：“我只承認反對國民黨和國民政府，卻不承認危害民國，因為政府并非國家……孫中山、黃興等曾推翻滿清政府，打倒北洋政府，如謂打倒政府就是危害國家，那么國民黨豈非已叛國兩次？”旁聽席上傳出一陣哄笑。