1922年8月，中共中央在杭州西湖召開特別會議，決定同國民黨進行兩黨合作。國共合作成為中國共產(chǎn)黨的頭等大事。

1923年6月，毛澤東出席在廣州召開的中共三大。三大的中心議題是討論國共合作問題。會上，張國燾提出：工人階級應(yīng)該在“自己政黨旗幟下”進行革命，“若加入了資產(chǎn)階級性的國民黨組織，便不免有混亂無產(chǎn)階級思想的危險”。張國燾反對共產(chǎn)黨員加入國民黨，也反對在工人、農(nóng)民中發(fā)展國民黨組織。毛澤東針對張國燾的發(fā)言，依據(jù)自己領(lǐng)導(dǎo)安源路礦、長沙泥木工人罷工中注意團結(jié)各方人士的經(jīng)驗，論證工人加入統(tǒng)一戰(zhàn)線的必要性，贏得多數(shù)代表的支持。大會接受共產(chǎn)國際于同年1月12日通過的在中國實行國共合作的決議，通過《關(guān)于國民運動及國民黨問題的決議案》，決定同國民黨合作，建立各民主階級的革命統(tǒng)一戰(zhàn)線。

在中共三大上，毛澤東被選為中央執(zhí)行委員和由五人組成的中央局成員。隨后，又被推為秘書，協(xié)助委員長陳獨秀處理日常事務(wù)，起草、聯(lián)署文件（按規(guī)定，中央發(fā)出的文件必須由委員長和中央局秘書聯(lián)名簽發(fā)），掌管黨的組織工作。中共三大期間，毛澤東捎信給當(dāng)時任中共湘區(qū)委員會負責(zé)人的李維漢，指示他注意在安源產(chǎn)業(yè)工人中發(fā)展國民黨組織。湘區(qū)委接受他的建議，委派何叔衡、劉少奇與國民黨元老覃振等組織籌備組。

中共三大后，毛澤東駐上海中央局機關(guān)。為促進第一次國共合作盡快實現(xiàn)，他經(jīng)常通宵達旦地審閱和起草各種黨內(nèi)文稿，同時還在黨的機關(guān)刊物《向?qū)А分軋笊喜粩喟l(fā)表文章，號召建立全國各階層的聯(lián)合戰(zhàn)線，同心協(xié)力地進行反帝反軍閥的國民革命。他在《北京政變與商人》一文中強調(diào)指出：“中國現(xiàn)在的政治問題，不是別的問題，就是簡單的一個國民革命問題。用國民的力量來打倒軍閥并打倒和軍閥狼狽為奸的外國帝國主義，這是中國國民的歷史使命”。為完成這個神圣的歷史使命，他呼吁全國各階層人民團結(jié)起來，建立一個“嚴密的聯(lián)合戰(zhàn)線”，“用革命的方法，開展一個新時代，創(chuàng)造一個新國家”!

為貫徹中共三大關(guān)于國共合作的決議，毛澤東于1923年9月又專程回到湖南，指導(dǎo)中共湘區(qū)區(qū)委籌組國民黨湖南地方組織。9月28日，他致信當(dāng)時的國民黨黨務(wù)部部長彭素民、副部長林伯渠，談在湖南發(fā)展國民黨工作。他說：“關(guān)于本黨在湘發(fā)展，雖在軍事時代仍應(yīng)努力進行，昨與夏希同志(夏希極能做事，在學(xué)生界有力量)商議分三步辦法：第一步組織長沙支部；第二步組織常德衡州及其它可能的分支部；第三步再組織湖南總支部。關(guān)于長沙支部，現(xiàn)決定即日租定房子成立籌備機關(guān)(秘密的)，多邀信仰三民主義及有活動能力的人入黨，然后開成立會推出候補支部長，呈請本部委任”。在毛澤東的推動下，10月初，國民黨長沙支部成立。次年4月，組織了湖南省臨時省黨部。1925年10月，正式建立國民黨湖南省黨部。

1923年冬，毛澤東受命離開湖南，赴廣州參與籌備中國國民黨第一次全國代表大會。在共產(chǎn)國際和中國共產(chǎn)黨的幫助下，孫中山于1924年1月20日到30日在廣州主持召開國民黨“一大”，確立了聯(lián)俄、聯(lián)共、扶助農(nóng)工的政策。毛澤東出席大會還就《組織國民政府之必要》、《出版及宣傳問題》、《本黨設(shè)立研究會》、《比例選舉制》等議案作了發(fā)言，闡述自己的立場和觀點，推動大會在國共合作問題上朝著正確的方向發(fā)展。30日，毛澤東被大會選為國民黨候補中央執(zhí)行委員。

國民黨“一大”的召開，標(biāo)志著第一次國共合作的正式建立。以此為契機，揭開了轟轟烈烈的大革命高潮。

國民黨“一大”結(jié)束的次日，毛澤東參加了由孫中山主持召開的國民黨一屆一中全會。會議決定派遣中央執(zhí)行委員分別在上海、北京、漢口、哈爾濱、四川五處組織執(zhí)行部，以中央直屬機構(gòu)的名義全權(quán)領(lǐng)導(dǎo)各地區(qū)的黨務(wù)。會后，毛澤東以候補中央執(zhí)行委員的身份參加上海、北京、漢口、哈爾濱、四川五處組織執(zhí)行部，以中央直屬機構(gòu)的名義全權(quán)領(lǐng)導(dǎo)各地區(qū)的黨務(wù)。會后，毛澤東以候補中央執(zhí)行委員的身份參加上海執(zhí)行部的實際領(lǐng)導(dǎo)工作，以主要精力從事統(tǒng)一戰(zhàn)線的工作。2月25日，上海執(zhí)行部第一次執(zhí)行委員會會議議決由毛澤東代理秘書科主任職務(wù)和組織部秘書職務(wù)。毛澤東在擔(dān)任這兩個職務(wù)期間，按照國民黨“一大”的要求，主持組織部負責(zé)對國民黨員的重新登記工作。毛澤東在上海執(zhí)行部一直工作到1924年12月，他團結(jié)國民黨左派，對國民黨右派破壞國共合作的行徑進行堅決的斗爭。如1924年8月1日，在葉楚傖的策劃下，一些國民黨右派在上海南方大學(xué)召開代表會議，討論所謂“處置共產(chǎn)分子問題”。當(dāng)即激起左派的反對，還造成武斗。后來，右派分子又闖入上海執(zhí)行部，毆打邵力子。事件發(fā)生后，毛澤東、惲代英等14人聯(lián)名上書孫中山，控告葉楚傖“主持不力，跡近縱容”的破壞國共合作罪行。此后，毛澤東和葉楚傖的斗爭公開化，毛澤東多次及時揭露葉的分裂行徑，葉也因此嫉恨毛澤東。由于葉楚傖的排擠、打擊、獨斷專行，也由于在國共合作策略上毛澤東與陳獨秀的觀點有分歧，再加上他工作勞累，身體虛弱，失眠嚴重，毛澤東于1924年12月底請假回湖南“養(yǎng)病”。毛澤東借回鄉(xiāng)“養(yǎng)病”之機領(lǐng)導(dǎo)發(fā)動了韶山等地的農(nóng)民運動。

1925年9月上旬，毛澤東從湖南到達廣州。10月5日，國民黨中央黨部黨務(wù)會議決定由毛澤東代行國民黨中央宣傳部長職務(wù)。稍后，他又著手創(chuàng)辦《政治周報》，并擔(dān)任主編。